TESTE DE GRAM

1. ASSUNTO: teste básico para identificação de bactérias

2. MATERIAL:

   1. Colônias bacterianas: Xanthomonas campestris pv. campestris e Saccharomyces cerevisae (levedura, fungo, Gram +) (ou Streptomyces sp. ou Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)

   2. Lâminas de microscópio, óleo de imersão

   3. Cristal violeta, lugol, safranina, álcool, água

   4. Papel toalha ou higiênico

   5. Palitos de madeira

3. MÉTODO 1 (corantes)

   1. Faça um esfregaço com células oriundas de colônias jovens (24-48 h);

   2. Cubra o esfregaço com solução aquosa de cristal violeta e mantenha durante 1 min;

   3. Lave com água, evitando de aspergi-la diretamente no esfregaço;

   4. Cubra com lugol e mantenha durante 1 min;

   5. Mergulhe a lâmina em álcool 95%, mantenha por 30 s, agitando levemente, e seque-a ao ar; ou goteje álcool sobre o esfregaço até que não escorra mais corante;

   6. Cubra o esfregaço com safranina e mantenha durante 30 s;

   7. Lave com água, seque com papel filtro, sem tocar na área do esfregaço, e examine, inciando com o menor aumento, com a objetiva de imersão (10x100).

4. MÉTODO 2 (KOH)

   1. Coloque duas gotas de KOH de uma solução a 3% (p:v) em uma lâmina limpa;

   2. Transfira células bacterianas através de um palito de dente esterilizado para o KOH;

   3. Agite, com a ponta do palito, em movimentos circulares, misturando as células com a solução de KOH;

   4. Depois de 5-8 s, afaste e aproxime, alternadamente, o palito da superfície da lâmina.

   5. Se a viscosidade da gota aumenta e fios mucóides aparecem, a bactéria é Gram negativa. Se for Gram positiva, a suspensão não fica viscosa.

5. RELATÓRIO

   1. Observe os resultados dos testes e faça desenhos esquemáticos do que for visualizado.

   2. O relatório deverá ser entregue na próxima semana. Deverá incluir Introdução (contendo os objetivos do trabalho), material e métodos, resultados e discussão, conclusões e relação da bibliografia consultada.

6. QUESTÕES

   1. Por que as bactérias Gram positivas aparecem coradas de azul?

   2. Por que as bactérias Gram negativas se colorem de rosa?

   3. Qual a função do álcool no Teste de Gram?

   4. Em que se baseia o Teste de Gram?

   5. Quais os grupos de organismos que reagem ao Teste de Gram?

   6. Por que as bactérias Gram negativas formam fios na solução de KOH?

Solução de cristal violeta: cristal violeta (0,2 g) + álcool (5 ml) + água (95 ml)

Solução de lugol: iodo (1 g) + iodeto de potássio (2 g) + água (300 ml)

Safranina: solução alcoólica saturada de safranina (100 ml) + água (1000 ml)

Assinale as sentenças com V (verdadeira) ou F (falsa)

( ) Thomas Jonathan Burril (1839-1916) é considerado como o primeiro a descrever uma doença de planta causada por bactéria.

( ) Alfred Fischer (1897), um botânico e químico alemão, criticava os trabalhos de Erwin Smith, dizendo que bactérias invariavelmente eram contaminantes, incapazes de causarem doenças em plantas.

( ) O assunto da polêmica entre Alfred Fischer e Erwin Frink Smith foi a etiologia bacteriana das doenças de plantas.

( ) Erwin Frink Smith é considerado o “Pai da Fitobcteriologa” pelas suas publicações, luta para o reconhecimento da Fitobacteriologia como ciência, grande número de registros e descrições de doenças bacterianas e pela escola científica que desenvolveu juntamente com seus inúmeros orientados.

( ) O grande mérito de Walter H. Burkholder (~1930) foi o estudo comparativo de bactérias fitopatogênicas em grande escala, colocando-as nos gêneros Agrobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Pseudomonas, Streptomyces e Xanthomonas.