TESTE DE GRAM

1. ASSUNTO: teste básico para identificação de bactérias

2. MATERIAL:

   1. Colônias bacterianas: Xanthomonas campestris pv. campestris e Saccharomyces cerevisae (levedura, fungo, Gram +) (ou Streptomyces sp. ou Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)

   2. Lâminas de microscópio, óleo de imersão

   3. Cristal violeta, lugol, safranina, álcool, água

   4. Papel toalha ou higiênico

   5. Palitos de madeira

3. MÉTODO 1 (corantes)

   1. Faça um esfregaço com células oriundas de colônias jovens (24-48 h);

   2. Cubra o esfregaço com solução aquosa de cristal violeta e mantenha durante 1 min;

   3. Lave com água, evitando de aspergi-la diretamente no esfregaço;

   4. Cubra com lugol e mantenha durante 1 min;

   5. Mergulhe a lâmina em álcool 95%, mantenha por 30 s, agitando levemente, e seque-a ao ar; ou goteje álcool sobre o esfregaço até que não escorra mais corante;

   6. Cubra o esfregaço com safranina e mantenha durante 30 s;

   7. Lave com água, seque com papel filtro, sem tocar na área do esfregaço, e examine, inciando com o menor aumento, com a objetiva de imersão (10x100).

4. MÉTODO 2 (KOH)

   1. Coloque duas gotas de KOH de uma solução a 3% (p:v) em uma lâmina limpa;

   2. Transfira células bacterianas através de um palito de dente esterilizado para o KOH;

   3. Agite, com a ponta do palito, em movimentos circulares, misturando as células com a solução de KOH;

   4. Depois de 5-8 s, afaste e aproxime, alternadamente, o palito da superfície da lâmina.

   5. Se a viscosidade da gota aumenta e fios mucóides aparecem, a bactéria é Gram negativa. Se for Gram positiva, a suspensão não fica viscosa.

5. RELATÓRIO

   1. Observe os resultados dos testes e faça desenhos esquemáticos do que for visualizado.

   2. O relatório deverá ser entregue na próxima semana. Deverá incluir Introdução (contendo os objetivos do trabalho), material e métodos, resultados e discussão, conclusões e relação da bibliografia consultada.

6. QUESTÕES

   1. Por que as bactérias Gram positivas aparecem coradas de azul?

   2. Por que as bactérias Gram negativas se colorem de rosa?

   3. Qual a função do álcool no Teste de Gram?

   4. Em que se baseia o Teste de Gram?

   5. Quais os grupos de organismos que reagem ao Teste de Gram?

   6. Por que as bactérias Gram negativas formam fios na solução de KOH?

Solução de cristal violeta: cristal violeta (0,2 g) + álcool (5 ml) + água (95 ml)

Solução de lugol: iodo (1 g) + iodeto de potássio (2 g) + água (300 ml)

Safranina: solução alcoólica saturada de safranina (100 ml) + água (1000 ml)

Assinale as sentenças com V (verdadeira) ou F (falsa)

( ) Thomas Jonathan Burril (1839-1916) é considerado como o primeiro a descrever uma doença de planta causada por bactéria.

( ) Alfred Fischer (1897), um botânico e químico alemão, criticava os trabalhos de Erwin Smith, dizendo que bactérias invariavelmente eram contaminantes, incapazes de causarem doenças em plantas.

( ) O assunto da polêmica entre Alfred Fischer e Erwin Frink Smith foi a etiologia bacteriana das doenças de plantas.

( ) Erwin Frink Smith é considerado o “Pai da Fitobcteriologa” pelas suas publicações, luta para o reconhecimento da Fitobacteriologia como ciência, grande número de registros e descrições de doenças bacterianas e pela escola científica que desenvolveu juntamente com seus inúmeros orientados.

( ) O grande mérito de Walter H. Burkholder (~1930) foi o estudo comparativo de bactérias fitopatogênicas em grande escala, colocando-as nos gêneros Agrobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Pseudomonas, Streptomyces e Xanthomonas.

Patovar, Subespécie, Serotipo: Qual a diferença?

Patovar é uma estirpe bacteriana ou um grupo de estirpes com as mesmas caracterísitcas ou muito similares, que são diferenciadas a nível infrasubespecífico de outras estirpes da mesma espécie com base nas diferenças (patogenicidade) na gama de hospedeiros.
Patovares são denominados como um terceiro nome, em adição a denominação binomial. Por exemplo, o agente causal da Mancha Bacteriana do maracujá pertence a espécie Xanthomonas axonopodis, sendo que o nome infrasubespecífico é X. axonopodis pv. passiflorae. Já o agente causal do Cancro Cítrico é denominado X. axonopodis pv. citri. Pseudomonas syringae pv. lachrymans é outro exemplo.
Veja mais exemplos de patovares: http://www.isppweb.org/names_bacterial_xant.asp; http://www.ag.uidaho.edu/bacteriology/

Em 1980, mais do que 90% de todas as Pseudomonas e Xanthomonas fitopatogênicas foram transferidas para Pseudomonas syringae e Xanthomonas campestris, respectivamente, como patovares. O termo patovar foi criado para preservar o nome de fitopatógenos, mas não tem respaldo na nomenclatura oficial (Schaad et al., 2000. Evaluation of proposed amended names of several pseudomonads and xanthomonads and recommendations. Phytopathology 90:208-213).

Subespécie é um grupo taxonômico imediatamente abaixo de espécie, da mesma forma que patovar. No entanto, se diferencia de espécie pois tem algumas características bioquímicas e fisiológicas distintas, e de patovar por poder ou não se diferenciar pela especificidade hospedeira. O principal atributo de patovar é a gama de hospedeiro. Estirpes de uma subespécie se diferenciam por outras características além de gama de hospedeiros.
Acidovorax avenae subsp. citrulli (Mancha Aquosa do Melão)
Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Podridão Anelar da Batata)
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cancro Bacteriano do Tomateiro)

The International Standards for Naming Pathovars of Phytopathogenic Bacteria, Pathovar Definition: http://www.isppweb.org/about_tppb_naming.asp

Serotipo. Estirpe ou estirpes de um serotipo são distinguidas por uma combinação singular de antígenos flagelares ou da parede celular. Assim, estirpes de diferentes serotipos são distinguidas por sua reação aos antissoros.

Função da catalase

A função da catalase é decompor o peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e oxigênio. O peróxido de hidrogênio é formado durante a respiração aeróbica normal, porém ele é tóxico para as células. Desta forma os microrganismos desenvolveram esta enzima que é capaz de neutralizar a ação tóxica. Normalmente, microrganismos anaeróbios obrigatórios não produzem a enzima catalase.


Teste da catalase:
Uma gota de peróxido de hidrogênio a 3% (v/v) é depositada numa lâmina de microscópio; uma amostra de células do microrganismo é então transferida para esta gota. Se aparecerem bolhas, o organismo é catalase-positivo, se não, é catalase-negativo. As bolhas são formadas pelo oxigênio molecular liberado na reação da catalase.
Observação: a prova não deve ser executada sobre colônias desenvolvidas em meio de cultura ágar-sangue; as hemácias produzem catalase, o que poderia levar a resultados falsos-positivo.


Fonte:
http://pt.wikipedia.org/wiki/Catalase

Antunes, G.S. Manual de Diagnóstico Bacteriológico. Editora da Universidade, UFRGS, 2ª edição, 1995, p.220-221.

Assunto organizado pela estudante Margaroni Fialho de Oliveira.